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原标题:独家 | 事关下个诺贝尔奖:美国科学界激辩基因

浏览次数:97 时间:2019-10-14

革命性基因编辑技术CRISPR渐成科学家新宠

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Eric Lander(左)VS Jennifer Doudna(右)

当病毒攻击细菌时,细菌会作出以DNA为目标的防御反应,生物学家利用此机理研发基因工程技术。

编者按:

图片来源:EYE OF SCIENCE

绝大部分科学家并非像宣传文章里说的不计名利,更不是有些人假扮的清心寡欲、高风亮节,而是很在乎功劳的归宿。

如果只是一份报告发表的话,仅会获得一些关注。但是当有6份报告同时发表时,这便意味着它是大势所趋。

竞争是事实存在的,无须标榜“不争”以欺世盗名。只是,在中国这样的名利之争一般尽可能不公开,但这两天美国生物学界的激烈争论甚嚣尘上,部分争论公开了……就这次争议,《知识分子》独家采访了关键当事科学家。

细菌也会生病,这对于乳品业来说是一个潜在的大问题。乳品业通常依靠细菌生产酸奶和乳酪。嗜热链球菌将牛奶中的乳糖分解为有刺激性的乳酸。但是某些病毒,诸如噬菌体能逐步削弱细菌,进而对在细菌作用下生产的食物的质量或数量造成严重损害。

从这样的事例中可以看到,国际科学界争论是文明争论,摆事实讲道理公开进行,不是捣浆糊,不是背后一堆告状信,更不是……我们需要清醒地认识到,何为竞争,如何竞争,怎样建立公平竞争的制度和环境?

2007年,来自丹尼斯克公司(一家总部位于丹麦哥本哈根的食品添加剂公司,目前被杜邦公司收购)的科学家找到了一种能增强细菌防御噬菌体能力的方法。这一发现使得杜邦公司能够为食品生产培育更强壮的菌株。一些基本的原理也被揭示:细菌具备一种有高度适应性的免疫系统,使得它们能击退来自某种噬菌体的多次进攻。

文 | 陈晓雪  王承志叶水送**

突然之间,不仅是食品科学家和微生物学家,很多领域都意识到细菌免疫系统的重要性,因为它具备一个非常有价值的特性:以某个特定的基因序列为目标。今年1月,4个研究团队报告了这一被称为CRISPR的系统。在接下来的8个月中,许多科研团队利用它来删除、添加、激活或抑制人体、老鼠、斑马鱼、细菌、果蝇、酵母、线虫和农作物细胞中的目标基因,从而证明了这个技术的广泛适用性。

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美国哈佛大学的George Church说,生物学家最近开发了一些新方法来精确操纵基因,“但CRISPR的功效和易用性在各方面都更胜一筹”。Church的实验室是首批将该技术应用于人体细胞的实验室之一。

1月14日,国际三大学术期刊之一Cell杂志在线发表了麻省理工学院教授、Broad研究所所长Eric Lander一篇关于基因编辑技术CRISPR发现历史的综述,并介绍了这一技术发展重要节点上的科学家。

基于CRISPR,科学家构建人类疾病小鼠模型的速度要比之前快得多,研究单个基因则更为快速,能立刻容易地改变细胞中的多个基因,以便研究它们的相互作用。但是今年研究CRISPR的热潮可能会减退,因为这种方法的局限性开始显现。但Church和其他CRISPR的先驱者已经成立了公司,希望利用这项技术治疗遗传性疾病。美国波兹曼市蒙大拿州立大学生物化学家Blake Wiedenheft说:“我不认为有任何领域的任何例子能够说明这项技术发展得过快。”

三天之后,加州大学伯克利分校的分子生物学家Jennifer Doudna公开驳斥这篇文章。美国科学界关于CRISPR的纷争的讨论再次升温。

这种新基因工程工具于1987年被首次报道,一个研究团队在一个细菌基因的一端观察到一个奇怪的重复序列。这一现象当时并未引起太多人的注意。十年后,破译微生物基因组的生物学家经常发现类似令人费解的模式(一个DNA序列紧跟着几乎完全相同但以相反方向构造的序列)。这一模式出现在超过40%的细菌和90%的古生菌中。

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很多研究人员假定这些奇怪的序列是毫无意义的,但是2005年,三个生物信息学团队报告,间隔区DNA通常和噬菌体的基因序列相匹配,表明CRISPR在微生物免疫中可能发挥了作用。加州大学伯克利分校生物化学家Jennifer Doudna说:“这是一个非常重要的线索。”而马里兰州贝塞斯达市美国国家生物技术信息中心的Eugene Koonin和他的同事则提出,细菌和古生菌占据了噬菌体DNA,之后将其作为RNA分子(能阻止外来DNA的匹配)的一个模板保存起来,就像真核细胞利用一个被称作核糖核酸干扰的系统摧毁RNA一样。

Eric Lander在Cell杂志上写了一篇关于CRISPR方面的综述,CRISPR技术的开拓者之一Doudna对此表示抗议,称介绍自己的“成就”存在“事实错误”。

2007年,丹尼斯克团队的Rodolphe Barrangou、Philippe Horvath和其他人证明,他们能通过添加或删除和噬菌体DNA相匹配的间隔区DNA,改变嗜热链球菌对噬菌体攻击的抵抗力。在那时,Barrangou(目前就职于美国罗利市北卡罗来纳州立大学)并未充分发挥CRISPR的全部潜能。他说:“我们还不清楚这些元素能否像引人注目的基因编辑技术那样,成为随时可利用的技术。”

在美国国家生物技术信息中心(NCBI)的网站,她在这篇文章下面评论道,虽然Cell的编辑声称作者(Eric Lander)直接参与向相关的个人作了大量的事实核对,但是这篇文章对她实验室的研究以及与其他科学家互动的描述,“在事实上是错误的”,“作者没有核实(这些事实),而且文章在发表之前我并未同意”。

Doudna与目前任职于德国亥姆霍兹感染研究中心和汉诺威医学院的Emmanuelle Charpentier开展了下一个步骤。它们独立地梳理了各种和CRISPR相关的蛋白质所发挥的作用,研究间隔区DNA如何在细菌的免疫防御中发挥作用。但是这两名专家很快转而研究依赖一种被称为Cas9的蛋白质的CRISPR系统,因为这个CRISPR系统比其他CRISPR系统更简单。

《麻省理工科技评论》高级编辑Antonio Regalado博士在Twitter公布了这段留言的真实性,他表示,通过邮件询问Doudna博士,PubMed的这段文字是否是她本人所写?Doudna回答,“是的,PubMed上的评论是我用自己的账户发的。请注意,我当时也试图在Cell网站发表相同的意见,但它没有被Cell的编辑接受。”

遭遇噬菌体入侵时,CRISPR会作出反应,此时细菌把间隔区DNA和DNA回文序列转录成一串长的RNA分子。tracrRNA(一个额外的RNA片段)和Cas9一起作用产生crRNA(源自间隔区的RNAs)。Charpentier的团队于2011年将这一发现报告在《自然》杂志上。该团队提出,Cas9、tracrRNA和crRNA一起以某种方法攻击和crRNA配对的外来DNA。

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速度并不是CRISPR的唯一优势。Church的团队正在推广TALENs在人体细胞中的使用。在3种类型的人体细胞中,在切割目标DNA方面,CRISPR系统要比TALENs更高效,且能比TALENs处理更多的基因。为了说明CRISPR系统的简便性,Church的团队合成了成千上万的向导RNA序列——可锁定90%的人类基因。

Regalado博士通过邮件证实了这段文字的真实性。

几乎和Church的论文同时出现的一篇独立研究论文(由美国马萨诸塞州博德研究所合成生物学家Feng Zhang和他的同事完成)显示,CRISPR能立刻锁定和切割人体细胞中的两个基因。在和马萨诸塞州怀海德生物医学研究所发育生物学家Rudolf Jaenisch的合作中,Zhang分裂了小鼠胚胎干细胞中的5个基因。

谁是CRISPR英雄?

这些工作为培育变异老鼠打下了基础,这是生物医学研究的一个关键工具。一个方法是,将发生突变老鼠的胚胎干细胞植入一个正在生长的胚胎中。他的团队发现,这能简单地将Cas9信使RNA和两个向导RNAs注入老鼠的卵子或受精卵中。

2013年初,CRISPR技术被证实可以在活体真核生物中做到精确而有效的基因组编辑。此后,CRISPR技术给科学家带来了暴风骤雨般的改变,无论是在生物医学领域还是农业领域,成千上万个实验室开始使用并应用这一技术。

根据Zhang的CRISPR技术,一个新的小鼠模型即将在几周内投入测试。Zhang认为,这种方法并不局限于老鼠。只要你能操纵胚胎并重新植入胚胎,你将可以在更大型的动物上开展该研究。

“我还不曾见过有分子生物学家还没有听说过CRISPR”,Eric Lander在文章开头写的CRISPR技术发展历程中的这一重要工作,虽然并未提及其在Broad研究所的同事、华裔科学家张锋是最主要的贡献者,但是在学界这并非什么秘密。

在Zhang和Church的报告在线发表3周之后,Doudna的团队和一个韩国研究小组报告称,他们成功利用CRISPR切除了人体细胞的DNA。与此同时,另外一个小组透露,他们利用CRISPR创造出变异的斑马鱼。一系列的研究报告造成了协同效应,为生物界赢得了广泛的关注。北卡罗来纳州达勒姆市杜克大学生物医学工程师Charles Gersbach说:“如果只是一份报告发表的话,仅会获得一些关注。但是当有6份报告同时发表时,这便意味着它是大势所趋。”

CRISPR技术的重要性,已是人尽皆知。实际上在此前的2012年,科学家们报道CRISPR-Cas9系统可以作为简单、灵活的基因组编辑工具,其中涉及的三位最重要的科学家正是Eric Lander这篇文章引起争议的主角。

一年前,当高彩霞看到Doudna和Charpentier的研究报告后,她被他们的理论所折服。高彩霞的团队来自北京市中国科学院遗传与发育生物学研究所,她们已经利用锌指结构和TALENs技术在大米和小麦上进行研究。通过利用CRISPR,她的团队已经成功地令大米的4种基因失去功能,这意味着该技术可以用于改良大米这种重要的农作物。至于小麦,她们剔除了一种基因,使小麦获得了白粉病抗性。CRISPR的进展令人兴奋,高彩霞团队的研究报告发表在8月刊的《自然—生物技术》上,与此同时,还有另外4篇关于CRISPR在植物和老鼠身上的研究成果的报告同期发表。

到底谁是CRISPR的英雄?Eric Lander在这篇标题为“The Heroes of CRISPR”的文章试图给出答案。

CRISPR的使用成本很低:免费的软件使得设计向导RNA(用于针对特定的基因)的成本为零,另外只需花费65美元便可以从名为Addgene的基因资源库中获取基因,来设计自己的CRISPR系统。自今年开始,Addgene(共有11个科研小组为它提供了可用于CRISPR系统的DNA序列)已经见证了5000种CRISPR构造的产生。今年7月,Addgene在一周内就收到了(为了设计一种新构造的)100份订单,Addgene的执行董事Joanne Kamens说:“Addgene正在热卖中。”(原标题《CRISPR狂潮“来势汹汹”》)

在文章中,他刻画了一个CRISPR英雄谱,描述了一个由十几位科学家组成的、令人心潮澎湃的乐团,他们发现CRISPR系统,揭示出它的分子机制,并将其改造成强大的生物学研究和生物医学研究的工具。

《中国科学报》 (2013-08-27 第3版 国际)

Lander在文章中回顾道,CRISPR的故事始于西班牙阿利坎特省的白色海岸。1993年,西班牙科学家Francisco Mojica首先在嗜盐古细菌(Haloferax mediterranei)的基因组中发现了大约30个碱基对(bp)长度的回文重复序列,这些序列由36bp的间隔序列隔开。

经过生物信息学序列比对方法, Mojica发现,CRISPR序列中三分之二的间隔序列为病毒或外源质粒的序列,他意识到CRISPR系统与细菌的获得性免疫有关。

与此同时,法国科学家Gilles Vergnaud和俄国科学家Alexander Bolotin在2005年分别独立得到与Francisco Mojica类似的结论,即CRISPR与细菌的获得性免疫有关。

此后,Cas7和Cas9蛋白在CRISPR系统中的作用逐渐被揭示,科学家们发现CRISPR系统的底物是DNA,他们也证实核酸酶Cas9可以在crRNA的指导下对特定序列的DNA进行切割。

一个关键的里程碑

CRISPR系统被证实作为准确、高效的基因编辑工具,是科学家们发现CRISPR-Cas9系统的充分必要组分,包括Cas9核酸酶,crRNA以及tracrRNA。

Eric Lander认为,国际上有两个研究团队对这一里程碑式的发现做出了贡献。其一是立陶宛科学家Virginijus Siksnys和他的合作者。

Eric Lander在介绍Siksnys与合作者2011年、2012年的工作时评价道,“于是这个领域达到了一个关键的里程碑:CRISPR-Cas9干扰系统的充分必要组分,包括Cas9核酸酶,crRNA,以及tracrRNA现在已经知道了。这个系统被优雅的生物信息学、遗传学和分子生物学所解析。现在是在试管中进行精确的生物化学实验来确认以及扩展这个系统的时候了”。

另一个被Eric Lander提到的是Jennifer Doudna和法国生物学家Emmanuelle Charpentier(现在就职于德国柏林马克斯普朗克研究所和默奥大学)的团队。

“Charpentier和奥地利的同事从生化特性的角度对CRISPR开始了研究。在2011年5月,于波多黎哥召开的美国微生物学会的会议中,她做了关于tracrRNA的报告,并遇见了加利福尼亚大学伯克利分校的全球知名的结构学家和RNA学家——Jennifer Doudna。Doudna成长于夏威夷,并在哈佛攻读其博士学位,在此期间和Jack Szostak一起工作,研究设计一种将RNA自我剪切型内含子转化成具有复制RNA模版能力的核糖酶。之后她在科罗拉多大学做博士后,和Tom Cech一起工作,研究核糖酶的晶体结构。实验室成立之后(1994年在耶鲁大学工作,2002年之后在伯克利工作),她主要探索各种现象下RNA-蛋白复合物的特性,例如内源的核糖酶进入位点和microRNA的形成过程。她利用晶体学和低温电子显微镜来探索Type I CRISPR系统中串联复合物各组分的结构,而这些复杂的系统一般都被应用于微生物中,例如大肠杆菌。”

Eric Lander写道,“两位科学家决定强强联手。他们利用重组的Cas9(来源于大肠杆菌中表达的S. pyogenes Cas9),以及体外表达的crRNA和tracrRAN。和Siksnys一样,他们也发现Cas9 能够在体外剪切纯化后的DNA,crRNA可以自由编辑,两个核酸酶功能域分别剪切两条链,以及crRNA和tracrRNA对Cas9而言都是必不可少的。此外,他们还发现当两个RNA融合在一个sgRNA上的时候,在体外同样也奏效。倘若这些sgRNA在体内也被证实能够有效的发挥作用的时候,sgRNA的概念将会被广泛的应用于基因组编辑中。”

值得注意的是,Eric Lander还详细介绍了两个团队投稿的过程。“Siksnys在2012年4月6日向Cell投递了他的文章。六天后,被杂志社直接拒绝。(事后,Cell的编辑表示这篇文章确实很重要。)Siksnys压缩了文稿,于5月21日投递到PNAS,并于同年9月4日才在线发表。而Charpentier和Doudna的文章相较而言进行地比较顺利,在Siksnys投稿两个月之后的6月8日,她们将文章投递到Science,并很快地通过审稿,于6月28日在线发表”。

“这两个团队均清晰地认识到生物技术的潜能,Siksnys表示这些发现将为通用的、可编辑的、RNA指导的人工核酸内切酶技术作铺垫,同时,Charpentier和Doudna也表示它在RNA指导的基因组编辑中具有很大的潜力。” Eric Lander总结说。

一石激起千层浪

Eric Lander的文章引起Doudna的强烈不满。她认为,作者对她实验室的研究以及与其他科学家的互动描述“在事实上是错误的”。

可是,具体到哪些事实是错误的,Doudna在PubMed上的评论并没有说明。在给《知识分子》的邮件回复中,Doudna说,“我和我的同事将在未来合适的时候进行回应。”

众所周知的是,Eric Lander所在的麻省理工学院Broad研究所和Jennifer Doudna所在的加州大学伯克利分校,正在为争夺CRISPR技术相关专利打得不可开交,CRISPR技术也被视为诺贝尔奖的热门领域。Eric Lander的文章发表之后,除了遭到Doudna的反驳指责之外,还遭受多位科学家的口诛笔伐。

一位不具署名的研究者在匿名同行评议网站PubPeer上表示,“对这篇文章中Eric Lander未能阐明其与CRISPR技术的利益冲突,我感到非常震惊和失望。他所领导的Broad研究所以及他曾发表的论文,在CRISPR技术专利上仍存在法律诉讼问题。Lander和Cell杂志的编辑需要阐明他们在本文中观点可能并不能让人们公正评价(CRISPR技术),此外缺乏利益冲突声明这一信息也是不合适的。事实上,如果是这样,这篇文章就根本不能发表。”

不过根据Eric Lander回复给《科学家》的声明,他已披露了“实际和可能产生的利益相关”,包括他所在的机构拥有CRISPR专利和专利申请。他还表示,他在12月中旬给Doudna发过邮件,请她对文章中的事实进行核实。

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